甲基丙烯酰胺
kinase, ATP analog, crosslinking
大家好，今天推荐一篇发表在Angew上的文章，An affinity-based, cysteine-specific ATP analog for kinase-catalyzed crosslinking，本文的通讯作者是来自美国韦恩州立大学的Pflum教授，他们课题组的目标是使用化学方法表征激酶和去乙酰化酶在癌症中的作用。
蛋白激酶通过磷酸化靶标蛋白实现细胞内的信号传导，激酶的功能破坏会直接导致疾病的发生，所以了解激酶中信号转导的底物就至关重要。在之前的研究中光交联ATP类似物可以有效地共价连接激酶和底物。但是UV照射以及非特异性反应导致目前使用ATP-光交联的方法来识别底物仍具有局限性。在本篇文章中作者报告了一个基于亲和标记的ATP交联类似物，很好地避免了传统光交联基团需要UV照射以及特异性差的问题。
目前已有的光交联ATP类似物是在ATP的γ位的磷酸基团上修饰一个可以光交联的基团，例如芳基叠氮化物以及二苯甲酮。这样通过UV照射，ATP类似物就可以取代ATP作为辅基与蛋白激酶进行光交联，供给底物的磷酸基团也会留在底物上，也就成功实现了将激酶-底物对提取出来的目标。为了避免新设计的交联ATP类似物也需要UV照射，作者开发了一个可以靶向特异氨基酸的类似物。因为大约有200个左右的蛋白激酶都具有反应性的半胱氨酸，所以作者就在γ磷酸基团上加入了甲基丙烯酰胺的交联基团，将其取名为ATP-Mac。当ATP类似物转移到底物上时，激酶的半胱氨酸可以与ATP类似物发生迈克尔加成反应，甲基丙烯酰胺的选择性是通过α甲基的亲电性降低实现的，所以会比较特异性的只与半胱氨酸反应。为了实现这个设计，作者通过分析EGFR激酶的结构研究了甲基丙烯酰胺与活性半胱氨酸反应时ATP-Mac与该半胱氨酸的距离。基于结构分析作者设计合成了γ-磷酸根和丙烯酰胺的亚甲基距离为22.0 ? 和12.4 ? 的两个ATP-Mac类似物。
为了检测这两个类似物的反应性，作者首先用荧光标记在PKA激酶和髓磷脂蛋白（MBP）上进行了检测。如果可以成功标记则PKA将ATP-Mac的磷酸基团转移到MBP上，随后甲基丙烯酰胺与还原性的FITC-thiol反应，对MBP进行荧光标记。实验结果显示MBP在ATP-Mac-1和2存在的情况下都可以很好地被标记，而用星孢素抑制激酶则没有显示出荧光。该结果表明了两个类似物可以作为辅基参与有半胱氨酸的激酶反应。随后作者有对其磷酸化效率进行了评估，实验发现，与ATP相比ATP-Mac-1的转化率为68.9%；ATP-Mac-2的转化率为60.9%。该类似物的反应效率都在可接受的范围，而ATP-Mac-1将用于进一步的研究中。
作者又进一步的研究了该类似物的适用性和特异性。实验发现该类似物只能对具有半胱氨酸的激酶进行交联，并且对很多种激酶都有效。作者最后在复杂的裂解液中进行进一步验证。通过用EGF激活Hela细胞中的EGFR激酶，作者用类似物与裂解混合物进行反应，通过SDS-PAGE分离，作者在相应的分子量上看到了交联的条带，通过加入激酶的抑制剂，该复合物显著减少，这些结果都表明在具有谷胱甘肽等干扰物的细胞裂解液中，ATP-Mac也可以以激酶依赖的方式对底物进行捕获。
总之，本文开发了一个基于亲和标记的交联ATP类似物，该类似物可以在细胞裂解液中进行激酶依赖性的交联，为磷酸化依赖的激酶识别提供了强大的工具。
文章作者：WYK
责任编辑：Guo ZH
原文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/anie.202014047
原文引用：DOI：10.1002/anie.202014047
